原理:直接培养支原体于培养基中,观察其生长及菌落生成
特点:是目最直接与灵敏之步骤,亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点:培养时间长,须3-5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如nis)。需同时培养支原体株作正反应对照组,可能会造成污染。
材枓:dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth(Difco0554-17-1)horseserum、15%yeastextractsolution(autoclaved)、Bactoagar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染,所以厌氧包应用无菌水,每次打开厌氧缸后,用70%ethanol擦拭内壁。)
培养基制备:基本配方为DifcoPPLObroth(60%),马血清(20%),15%yeastextreatsolution(10%),10xstocksolution(10%)。由于培养时间长,可加入penicillin(50u/ml)至10xstocksolution或加入thalliumacetate(1:2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
10xstocksolution(1liter):称取50gdextrose,10gL-arginineHCl,溶于1liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100ml至瓶中,保存于-70℃。
液体培养基(1liter):称取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred于600ml蒸馏水中,加热搅拌溶解之。灭菌121℃,15分钟。待温度降低至室温后,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution,及100ml解涷之10xstocksolution,混合均匀后,分装至已灭菌之有盖螺旋试管中,10ml/管。保存于4℃,期限1月。
固体培养基(1liter):称取21g之DifcoPPLObroth,0.02gphenolred,15gBactoagar于600ml蒸馏水中,加热溶解之。灭菌121℃,15分钟。放在50℃水中浴中,待温度降低至50℃时,于无菌操作台内加入200ml马血清,100ml之15%yeastextractsolution及100ml解冻之10xstocksolution,混合均匀后,倒入60x50㎜之无菌培养皿中,5ml/培养皿。保存于4℃,期限1个月。
步骤:
取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,接于液体培养基中,置于37℃培养二周,观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养周及二周后,分别取0.1ml液体培养液涂在agarplate上,将其倒放置于37℃厌氧箱培养,培养至少3星期,持续观察是否有支原体之菌落出现。
另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液,涂抹在agarplate上,37℃厌氧培养3星期,持续观察是否支原体菌落出现。
另作正负反应对照组,正反应对照组为Acholeplasmalaidlawii(ATCC23206)与ni(ATCC23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。
结果判读:
支原体生长较慢,所以先在液体培养基培养1~2周增殖后,再培养于agarplate上。需至少培养3星期后,才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。
典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried-egglike),乃是由于支原体往agar下层生长所致,为圆形无色透明菌落,小约10-55μm。但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落,有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态(slime)。
若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落,可将其自agarplate上切下,重新培养于液体培养基中,培养一星期后再种入agarplate,若是细胞则不会生长。